Serinc2基因敲除心肌肥厚小鼠模型

一、疾病概述 肥厚型心肌病 ( Hypertrophic cardiomyopathy) 是一种器质性心脏疾病，主要表现为左心室和(或)右心室及室间隔不对称肥厚、心室腔变小、心室顺应性降低。病因：肥厚型心肌病是常染色体显性遗传性疾病，60%～70%为家族性，30%～40%为散发性，家族性病例和散发病例、儿童病例和成年病例具有同样的致病基因突变。临床表现：1. 以青壮年多见、常有家族史。2. 可以无症状，也可以有心悸、劳力性呼吸困难、心前区闷痛、易疲劳、晕厥甚至猝死，晚期出现左心衰的表现。3. 梗阻性肥厚型心肌患者胸骨左缘可出现粗糙的收缩中晚期喷射性杂音，可伴震颤，应用洋地黄制剂、硝酸甘油、静点异丙肾上腺素及Valsalva动作后杂音增强，反之应用β受体阻滞剂、去甲肾上腺素、下蹲时杂音减弱。有些病人闻及S3及S4心音及心尖区相对性二尖瓣关闭不全的收缩期杂音。临床诊断：超声心动图提示左心室壁或（和）室间隔厚度≥15mm，排除了其他引起心肌肥厚的原因如高血压病、风湿性心脏病二尖瓣病、先天性心脏病（房间隔、室间隔缺损）及代谢性疾病伴发心肌肥厚。二、模型背景1、Serinc2基因信息• 敲除基因名称（NCBI号）：230779• 敲除基因NCBI网址链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/230779• 敲除基因名称：serinc2• 敲除基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Summary?db=core;g=ENSMUSG00000023232;r=4:130253495-130275218;t=ENSMUST00000122374• 方案针对的转录本（Ensembl号）： ENSMUST00000122374.7• 方案敲除的exon：exon 2-102、实验动物背景信息所采用的小鼠品系为C57BL/6。来源：1921年立特(Little)用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL1937年从C57BL分离出C57BL/6和C57BL/10两个亚系。1985年从Olac引到中国医学科学院实验动物研究所。C57BL/6小鼠也被称为C57 black 6，当然有的人也把它叫做B6，1921年被培育出来，属于近交品系。该品系的最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。另外C57BL/6小鼠是第一个完成基因组测序的小鼠品系，这也为它增加了不少的知名度。毛色：黑色。C57BL/6小鼠的主要用途有如下三个方面：• 作为生理学与病理学的实验动物模型• 构建转基因动物模型，百奥赛图多采用背景纯净的C57BL/6小鼠进行基因敲除，保证遗传背景上的高度稳定性和实验数据的一致性。• 作为产生自发突变和诱发突变的同基因型小鼠的背景品系。主要特性：①乳腺肿瘤自然发生率低，化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。②12%有眼睛缺损;雌仔鼠16.8%，雄仔鼠3%为小眼或无眼。用可的松可诱发腭裂，其发生率达20%。③对放射物质耐受力中等;补体活性高;较易诱发免疫耐受性。④对结核杆菌敏感。对鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干扰素产量较高。⑥嗜酒精性高，肾上腺素类脂质浓度低。对百日咳组织胺易感因子敏感。⑦常被认作"标准"的近交系，为许多突变基因提供遗传背景。主要用途：是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究中常用的品系。3、研究背景 Serinc2是Serinc（serine incorporate）蛋白家族的极其重要的一员，能帮助丝氨酸整合到细胞膜上,并促进细胞磷脂双分子层膜上的磷酯酰丝氨酸和鞘磷脂等成分的生物生成,在膜脂分子生物合成过程中起关键调节作用。极性氨基酸丝氨酸(serine)属于细胞内的一种非必需氨基酸,是磷脂酰丝氨酸和鞘脂的重要组成成分[1]。而serinc蛋白存在于所有的真核细胞的质膜中，和其他家族没有氨基酸序列同源性，其具体的功能尚未研究清楚。但本身高度保守，具有多个疏水结构域，几乎都编码一个N端信号肽，其家族成员内部有31%~58%的同源性。Serinc作为一种重要的跨膜蛋白家族，共有5个成员，serinc1~5，其膜拓扑结构具有类似氨基酸转运蛋白的11个跨膜区段，且均含有一个“helix-loop-helix"功能结构域[2]。 最初研究发现serinc蛋白生物学活性主要与肿瘤相关，能够在抑制细胞凋亡的同时促进肿瘤的发生[3]。研究发现serinc1能够阻滞肺癌细胞的周期进程，从而抑制肺癌组织的复制[4]。2003年，serinc2（又称为tumor differentially expressed 2, 肿瘤差异表达基因2 ）蛋白首次被科学家Player发现。目前，关于serinc2的相关报道较少，Player等[5]观察到serinc2在非小细胞肺癌中表达水平较高，并且在正常组织中serinc2不同的表达水平与细胞增殖的相对速度无关，提示serinc2在肺癌肿瘤发生的特殊作用。Zeng等[6]进一步发现serinc2在肺腺癌组织中高表达，其可能通过PI3K/AKT信号通路调控肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。另外，染色体芯片分析发现与自闭症发生相关的serinc2基因变异[7]。进一步通过全基因组关联研究和meta分析发现serinc2基因变异与欧洲人群酒精成瘾密切相关，并且可以作为酒精依赖风险的因素进行随访[8, 9]。 迄今为止尚未有研究发现serinc2与心血管疾病之间的关系，但是2015年，美国麻省大学医学院，意大利特伦托大学和瑞士日内瓦大学的研究团队同时在nature发表论文，揭示了serinc蛋白家族成员能够抑制HIV（human immunodeficiency virus,人免疫缺陷病毒）病毒颗粒的复制。在HIV感染时，两者能结合到病毒颗粒中并作为信号报警器阻止病毒的进一步增殖。参考文献：1. Muthusamy, T., et al., Serine restriction alters sphingolipid diversity to constrain tumour growth. Nature, 2020. 586(7831): p. 790-795.2. Pye, V.E., et al., A bipartite structural organization defines the SERINC family of HIV-1 restriction factors. Nat Struct Mol Biol, 2020. 27(1): p. 78-83.3. Bossolasco, M., et al., Human TDE1, a TDE1/TMS family member, inhibits apoptosis in vitro and stimulates in vivo tumorigenesis. Oncogene, 2006. 25(33): p. 4549-58.4. Ren, W.H., et al., siRNA-mediated knockdown of hTDE2 retards cell cycle progression through transcriptional activation of p21. Oncol Rep, 2014. 31(3): p. 1314-22.5. Player, A., et al., Identification of TDE2 gene and its expression in non-small cell lung cancer. Int J Cancer, 2003. 107(2): p. 238-43.6. Zeng, Y., et al., SERINC2-knockdown inhibits proliferation, migration and invasion in lung adenocarcinoma. Oncol Lett, 2018. 16(5): p. 5916-5922.7. Hnoonual, A., et al., Chromosomal microarray analysis in a cohort of underrepresented population identifies SERINC2 as a novel candidate gene for autism spectrum disorder. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 12096.8. Zuo, L., et al., Genome-wide association discoveries of alcohol dependence. Am J Addict, 2014. 23(6): p. 526-39.9. Zuo, L., et al., A New Genomewide Association Meta-Analysis of Alcohol Dependence. Alcohol Clin Exp Res, 2015. 39(8): p. 1388-95.

1. CRISPR/Cas9敲除策略：

Serinc2基因有5个转录本。根据Serinc2基因的结构，将 Serinc2-203基因的exon2-exon10(ENSMUST00000122374.7)转录本作为敲除区域。该区域包含了所有的编码序列。破坏这个区域将导致蛋白质功能的破坏。

在本项目中，我们使用CRISPR/Cas9技术对Serinc2基因进行修饰。简单的过程如下:sgrna在体外转录。Cas9和sgRNA微注射C57BL/6JGpt小鼠受精卵。移植受精卵获得F0阳性小鼠，经PCR和测序证实。F0代阳性小鼠与C57BL/6JGpt小鼠交配获得F1代小鼠稳定模型。

2.构建PE诱导的心肌肥大细胞模型，检测Serinc2敲低以及过表达后心肌肥厚分子标志物水平。分别提取总RNA，通过qRT-PCR检测心肌肥厚指标ANP、BNP、Myh6和Myh7的mRNA水平。

1.鉴定结果

根据PCR策略示意图，经PCR和测序确认，29#，30#，36#小鼠为F1代杂合子小鼠。

图1.PCR鉴定结果图。

2. Serinc2敲低对PE诱导的新生大鼠心肌细胞肥大水平的作用

敲低Serinc2的表达，且敲低效率达到80%。与对照组相比，敲低Serinc2后，心肌肥厚标志物ANP、BNP、Myhh7显著升高，表明敲低Serinc2基因加重了心肌肥厚水平。

图2.在新生大鼠心肌细胞中，敲除ArmH4基因对PE所诱导的心肌肥厚水平的影响。

3. Serinc2过表达对PE诱导的新生大鼠心肌细胞肥大水平的作用

结果表明，过表达Serinc2能使serinc2过表达70倍。与对照组相比，serinc2过表达后ANP、BNP的mRNA水平显著降低。上述实验结果表明，在PE诱导心肌细胞肥大模型中，敲低或过表达serinc2分别加重或者减轻心肌肥大，这为心肌肥厚的治疗提供了新的靶点。

图2.在新生大鼠心肌细胞中，过表达ArmH4基因对PE所诱导的心肌肥厚水平的影响。

模型动物饲养在武汉大学人民医院动物房SPF级动物实验室，实验动物使用许可证SYXK（鄂）2015-0027。

（1）建筑特点

门采用专用净化密闭门并配备观察窗。单向走道呈顺时针走向设计。屏障系统内共有大鼠饲养室1间，小鼠饲养室3间，隔离观察室1间，实验准备室1间，洁物存放室1间，清洗消毒室1间。此外，屏障系统外配有监控室、机房和配电室等。

（2）设计参数

室内温度：20～26°C；日温差：≤4°C；相对湿度：40%～70%；换气次数：15～20次/h；气流速度：≤0．2m/s；压强梯度：20～50Pa；空气洁净度：7级；菌落数：≤3个/皿；氨浓度：≤14mg/m3；噪声：≤60dB；Z低工作照度：≥200lx；动物照度：15～20lx；昼夜明暗交替时间：12/12h。

（3）通风和空调系统

动物实验室采用全新风中央空调通风系统。空气经过初、中、三级过滤器后进入实验室内环境。

（4）照明系统

一更、淋浴、二更、气闸、清洁走道、洁物存放处、污物走道、缓冲间和清洗消毒间、动物饲养室、实验准备间、隔离观察室和功能实验室等安装有手动和自动开关，根据实际需要，调节控制室内照明灯。未启用房间、清洁走道、洁物存放处、污物走道等在每日中午12点和晚上8点开启紫外线灯照射1h。

（5）通讯系统

因为SPF级动物实验室的环境和设施具有特殊要求，人员进入后不能随意出入，而室内外的联系又十分重要，故室内各房间均安装内部电话机，按照房间顺序编排电话号码，各室内电话可相互连通，并均与监控室总机保持联系，保证实验室内外信息的及时沟通。

（6）监控系统

对SPF级动物实验室的出入口、走道、实验动物饲养室、功能操作室等重要位置均安装了可作270°旋转的摄像机，能够及时了解设施的运行状态；也能有效督促实验人员执行科学的操作规程，避免人为因素造成室内环境和设施的污染；并对整个实验期间的动物状态和反应进行观察，减少对动物的滋扰。

（7）供水系统

SPF级实验动物饮用水以纯净水为宜。本实验室采用管道供水，将处理后的纯净水用塑胶管道输送到屏障系统内实验准备室，设置接水槽，为实验动物供应灭菌的饮用水和屏障系统内用水。要经常更换和清洗输水管道，清洗笼具的用水添加适当比例的84消毒液。

（8）供电系统、警报系统和消防设施

SPF级动物实验室要求全天候不间断供风和供电，如果出现故障，不能及时发现和处理，就可能导致环境设施的污染、动物感染或死亡，造成严重后果。因此应对SPF级动物实验室使用独立稳定的供电系统，并配备有应急电源。在中央空调机房控制室安装风机故障警报系统，以便及时检修和维护，保证设施的安全运行。

（9）消毒灭菌设备

为防止外界物品进入SPF级动物实验室时所携带的细菌污染室内环境和造成动物交叉感染，按照不同物品的特性，进行紫外线照射消毒、渡槽消毒液消毒或专用的机动门真空灭菌器消毒。

（10）动物饲养笼具

饲养大、小鼠的笼具聚碳酸脂材料的塑胶笼具，具有高透明、耐高压、耐高温、耐酸碱等特点。通用的不锈钢笼具长、宽、高分别为40、30、20cm，适用于单笼饲养有特殊要求的实验动物，配有底盘和食槽，确保实验动物有充足的采食和活动空间，同时也保证室内环境的清洁。

（11）垫料的选择和使用

在使用塑胶垫料时，垫料是大小鼠直接接触的铺垫物，起到吸湿、保暖和造窝的作用。垫料的好坏直接影响到大小鼠术后的恢复、生长发育和繁殖性能。目前，所使用的垫料主要有玉米秸垫料、刨花垫料。

（12）饲料配制

大小鼠的生产型饲料和维持型饲料必须严格按照国家标准，进行科学配制生产。每半年检测一次饲料的微生物指标和有效营养成分指标，保证饲料的质量。

目前关于serinc2蛋白主要集中于研究其作为逆转录病毒的抑制剂，在病毒增殖时，被包装进入病毒颗粒中，从而削弱这些病毒感染新的细胞的能力。另外，关于serinc2能够促进肿瘤发生的机制也越来越受到重视。一方面，目前尚无动物模型研究其与各种人类疾病的关系，因此，成功构建serinc2-KO的小鼠模型并探索serinc2蛋白在心血管疾病及其他疾病之间扮演的角色显得尤为重要。另一方面，serinc2蛋白帮助serine整合到细胞膜上，促进膜脂的生成，可以影响膜的流动性和完整性，而这是细胞维持内稳态的关键。Serinc2-KO的纯合子小鼠能否存活，在其身上会发生什么表型的变化都是一个待解之谜，通过构建serinc2-KO的小鼠模型，或许能帮助我们更加深入的了解serinc2家族甚至非必需氨基酸在生物过程中发挥的作用。